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(计量泵加药泵)层析技术总结介绍

时间:2021-06-01 20:20 点击:
1. 介质:如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。 
葡聚糖凝胶(sephadex):较强吸水性,与交联度成反比。 
应用范围:分级分离各种抗原与抗体;去掉复合物中的小分子物质,如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片;分析血清中的免疫复合物;分子量的测定。 商品:sephadexg,g值与交联度成反比。 颗粒越细,流速越慢,分离效果越好。 丙烯葡聚糖凝胶(sephacryl):反压低,机械性能好,分离速度快,分辨率高,理化稳定,在sds、6m盐酸胍、8m尿素中均可使用。 
应用范围:精细分离与纯化;去掉溶液中的小分子物质,如除盐、细胞色素及水解的蛋白质碎片;去除蛋白溶液中的热源类物质;分离蛋白、多糖与核酸;分子量的测定。 型号:s-100hr、s-200hr、s-300hr、s-400hr、s- 500hr、s-1000sf。 分离范围:m1×103~m1×108。 聚丙烯酰胺凝胶(生物胶bio-ge1p):完全惰性,适合蛋白、核苷(酸);酰胺键遇强酸水解。 使用范围:ph2~11。 琼脂糖凝胶(sepharose):孔径大、机械强度好、流速快,只适大分子如病毒颗粒的分离,强酸强碱能引起结构破坏,不耐高温,**好使用条件控制在ph 4~9之间,温度0~40℃。 superdex(pharmarcia公司,目前**佳凝胶过滤介质):流速快、反压低、非特异性吸附低、样品回收率高、理化稳定(0.1mol/l hcl或0.1 mol/l naoh中40℃保温400小时分辨力保持不变,1% sds、8mol/l尿素或6mol/l盐酸胍能保持良好的色谱性能)。 适应范园:大分子精细纯化。
2. 基本操作流程: 
凝胶选择: 
eg.除盐,粗中粒g-25/g-50 凝胶预处理: 
eg.g系,溶胀,过量缓冲液,冰箱/室温/沸水;s系,除去保存液中乙醇。除气泡,加热/抽真空。 
将干胶往水里加,边加边搅,以防凝胶结块,然后放到沸水浴中加热接近100℃,几个小时就可以使其溶胀,还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。但应注意尽量避免在酸或碱中加热(测ph),以免凝胶被破坏。 
层析柱选择: 
与样品量与分辨率相关,蛋白纯化,柱体积为样品体积的25~100倍,去盐等小分子,柱体积为样品体积的4~10倍;分辨率与长度成正比,长度一般<100cm,直径与长度范围(1:25~1:100),蛋白纯化为1:20~1:100,去盐等小分子为1:5~1:25,求高分辨率,可串连使用。 层析柱安装: 
检测各部件完好性→介质的水混合液搅拌均匀→装柱前层析柱底部灌水→装填(将层析柱与地面垂直
固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器,关闭层析柱出水口,向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液,将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中,然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内,使其自然沉降,等凝胶沉降约2-3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉积,这样凝胶粒水平上升,待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱,关闭出水口,通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5~1 ml/min),始终保护凝胶上端有一段液体,拆除柱顶装置,用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面)

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